por Dhirendra Ok Simanshu, Mark R Philips, John F Hancock
Dhirendra Simanshu dirige los esfuerzos de biología estructural en la Iniciativa RAS del NCI, en el Laboratorio Nacional de Investigación del Cáncer de Frederick. Su investigación se centra en la caracterización estructural de KRAS en complejo con varios reguladores y en la focalización de focos farmacológicos mediante el diseño de fármacos basado en estructuras.
John Hancock es decano ejecutivo de la Facultad de Medicina McGovern del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Texas en Houston. Su investigación se centra en las interacciones de las proteínas RAS en la membrana plasmática y en cómo la organización espaciotemporal de los lípidos de la membrana contribuye al ensamblaje y regulación de los complejos de señalización RAS.
Marcos Philips es profesor de Medicina, Biología Celular y Bioquímica en el Centro Oncológico Perlmutter de la Facultad de Medicina Grossman de la Universidad de Nueva York. Ha dirigido un laboratorio de biología celular molecular durante 30 años centrado en la modificación postraduccional y la focalización en la membrana de RAS y pequeñas GTPasas relacionadas. Sus numerosas contribuciones al campo incluyen la caracterización de la isoprenilcisteína carboxilmetiltransferasa, el tráfico de endomembranas y la señalización de RAS y, más recientemente, la localización diferencial y la función de las variantes de empalme de KRAS.
Las RAS GTPasas regulan diversas vías de señalización intracelular. Mutaciones en uno de los tres genes RAS (HRAS, KRASy NRAS) están presentes en casi el 20% de los cánceres humanos. Estas mutaciones oncogénicas hacen que RAS cambie al estado activo cargado de GTP, lo que resulta en la activación constante de efectores posteriores, incluida la quinasa RAF. La cuestión de si existen dímeros RAS y su importancia en la activación de las quinasas RAF es un tema de intenso debate en la biología RAS. La thought de los dímeros RAS se propuso inicialmente basándose en la observación de que las quinasas RAF funcionan como dímeros, lo que llevó a la thought de que la dimerización de RAS a través del dominio G podría iniciar la formación de dímeros RAF. La dimerización de RAS ha generado un interés appreciable como mecanismo necesario para la función de RAS y como objetivo potencial para la terapia en cánceres impulsados por RAS. Sin embargo, los estudios centrados en la dimerización de RAS han proporcionado pruebas contradictorias sobre la interfaz del dímero propuesta. Los dímeros RAS no se observan en solución y las técnicas experimentales basadas en células tienen una resolución limitada y están sujetas a resultados falsos positivos. En junio de 2022, organizamos un debate sobre la dimerización de RAS y el papel del dominio G en el 30.º aniversario de la Conferencia de investigación de verano de FASEB sobre la estructura, función y regulación de pequeñas GTPasas en Vermont. La discusión continuó en octubre de 2022 en el Cuarto Simposio de la Iniciativa RAS en Frederick, MD. Los investigadores de RAS generalmente estuvieron de acuerdo en que la agrupación de dos o más proteínas RAS no resulta de una asociación estable del dominio G sino más bien de interacciones entre los anclajes de membrana C-terminales de RAS y los fosfolípidos de membrana. Este consenso respalda que el mecanismo principal para la dimerización de RAS es la agrupación de proteínas RAS mediada por lípidos en lugar de interacciones mediadas por el dominio G. Recientemente, revisamos la evidencia de la dimerización de RAS y resumimos las discusiones de estas dos reuniones para la comunidad RAS en common en un Perspectiva publicado en Célula molecular.
Las proteínas RAS tienen un dominio G altamente conservado pero difieren en sus regiones hipervariables C-terminales (HVR), que sufren modificaciones postraduccionales para anclar RAS a la membrana celular para la señalización. Los estudios sobre la organización espacial de RAS en la valva interna de la membrana celular han demostrado que las moléculas de RAS existen como monómeros, pares y nanoclusters transitorios de vida corta que se difunden libremente y que contienen de 5 a 6 moléculas de RAS (1-4). Los nanoclusters son esenciales para el reclutamiento y la activación de efectores, y diferentes proteínas RAS se segregan en nanoclusters distintos, transitorios y dependientes de lípidos (4-6). Curiosamente, es el ancla C-terminal, no el dominio G, el que impulsa la agrupación y distribución de las moléculas RAS. Esta conclusión se basa en observaciones de que se observa la misma distribución espacial incluso cuando el dominio G está ausente o reemplazado por otras proteínas (6-9). Por ejemplo, KRAS4B etiquetado con mCherry y mCherry extendido con el HVR de KRAS4B exhiben la misma distribución de agrupamiento en estudios de seguimiento de moléculas individuales.2,10.
La organización espacial de RAS está determinada por la interacción del anclaje C-terminal con los fosfolípidos en la membrana plasmática (PM), lo que conduce a una segregación lateral mediada por lípidos, sin que el dominio G desempeñe un papel directo en el proceso. El ancla recluta lípidos específicos, formando un complejo lípido-proteína que actúa como componente básico de complejos de orden superior. Diferentes anclajes RAS reclutan diferentes lípidos, lo que resulta en una segregación lateral de isoformas RAS a menos que se altere la composición lipídica del PM. La desmezcla de lípidos impulsa la formación de complejos de orden superior, related a la formación de balsas de lípidos (11,12). KRAS permanece monomérico en bicapas lipídicas soportadas de dos componentes, pero se colocaliza con lípidos aniónicos en vesículas unilaminares grandes y se observa en grupos en láminas de PM intactas (4-6,13,14).
A pesar de la amplia evidencia que respalda el modelo de agrupamiento mediado por lípidos, muchos estudios se han centrado en caracterizar los homodímeros RAS mediados por interacciones del dominio G (15-19). Se han propuesto diferentes interfaces de interacción en el dominio G para la dimerización de RAS, incluidas interfaces formadas por hélices α3-α4, hélices α4-α5 y hebras β1/β2 (20). Sin embargo, las simulaciones de dinámica molecular encontraron que las interacciones RAS-RAS son interfacialmente inespecíficas y que todas las interfaces reportadas anteriormente son parte de un gran conjunto de posibles interacciones (21). Un estudio reciente no ha demostrado ningún impacto significativo de las sustituciones de aminoácidos α4-α5 en la autoasociación, señalización o transformación por RAS oncogénico (22). Además, los estudios sobre el ciclo de activación de los dímeros RAF han argumentado en contra del papel de los dímeros RAS (23-25).
La terminología que rodea la proximidad de las dos moléculas RAS en el PM también es un problema semántico. Mientras que los biólogos celulares pueden referirse a dos proteínas como formando un dímero si están muy juntas, los bioquímicos definen los dímeros de proteínas como dos protómeros que interactúan a través de residuos presentes en una interfaz específica con una constante de disociación en el rango nanomolar a micromolar. Es importante utilizar el término «dímero» sólo para los protómeros que se ajustan a la definición bioquímica. Los métodos actuales para detectar la proximidad de proteínas en células intactas no pueden distinguir los dímeros bioquímicos de otras formas de proximidad y, a menudo, producen resultados falsos positivos. Por tanto, son necesarios controles rigurosos, especialmente cuando las proteínas examinadas están sobreexpresadas. Por ejemplo, incluir otros miembros de la superfamilia RAS de pequeñas GTPasas que se localizan en el PM puede confirmar la especificidad de RAS.
Sobre la base de discusiones en dos reuniones, existe un consenso generalizado de que la proximidad de dos o más proteínas RAS en células o en membranas aisladas o artificiales no se debe a la autoasociación de los protómeros RAS a través de sus dominios G conservados, sino más bien a RAS. -Agrupación de protómeros RAS como resultado del anclaje de la membrana HVR y los fosfolípidos asociados que acercan las proteínas RAS ancladas a la membrana. Esta proximidad probablemente ocurre en nanoclusters donde dos o más protómeros RAS están lo suficientemente cerca como para formar dominios competentes en señalización basados en lípidos que no requieren interacciones específicas del dominio G. Las superficies de interacción superpuestas del dominio G de baja afinidad permiten el ensamblaje no aleatorio de la «carga» del dominio G en grupos impulsados por HVR. Los mutantes de repulsión de carga y la unión de monocuerpos pueden alterar el ensamblaje impulsado por el dominio lipídico y afectar la agrupación de RAS y la transmisión de señales. Las mutaciones en supuestas interfaces diméricas también pueden afectar las conformaciones de los anclajes, los cambios en las interacciones RAS-lípidos o las interacciones con efectores, GEF y/o GAP, lo que resulta en una reducción o pérdida de la señalización posterior. Por lo tanto, la disminución de la salida de señal no puede considerarse prueba de una dimerización bioquímica alterada.
La prisa por aceptar la dimerización mediada por el dominio G de RAS como un componente de señalización requerido ha llevado a algunos biólogos de RAS a utilizar este modelo para explicar fenómenos probablemente debidos a otros procesos. Cualquier estudio que invoque la heterodimerización de isoformas RAS debe considerar la estequiometría relativa de las proteínas RAS, ya que varía dramáticamente de un tejido a otro y de un tumor a otro (26). Los enfoques terapéuticos que apuntan a interferir con el GEF o las interacciones efectoras o interrumpir la nanoagrupación, por ejemplo, con monocuerpos y DARPins, son más prometedores que apuntar a interacciones específicas en una de las interfaces diméricas propuestas en el dominio G con moléculas pequeñas (22,27-29). ).
Por favor haga clic en el siguiente enlace para leer el Perspectiva publicado en Célula molecularque incluye una revisión exhaustiva de la evidencia sobre la dimerización de RAS y un resumen de las discusiones de dos reuniones recientes a las que asistieron investigadores de RAS.
